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參考資料(來源文獻)：

二、細胞(bao)培養(yang)操作

1) 復蘇(su)細胞(bao)(bao)(bao)：以下(xia)細胞(bao)(bao)(bao)培(pei)養(yang)凍存(cun)處理(li)僅供參考，具(ju)體(ti)操作步驟以隨貨產品說明(ming)書為主(zhu)。將(jiang)含有(you)1 mL細胞(bao)(bao)(bao)懸液的凍存(cun)管在 37℃水浴中(zhong)(zhong)迅速搖晃解凍，加4 mL培(pei)養(yang)基(ji)混合(he)均(jun)勻。在1000 rpm條件下(xia)離(li)心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培(pei)養(yang)基(ji)后(hou)吹勻。然后(hou)將(jiang)所有(you)細胞(bao)(bao)(bao)懸液加入(ru)(ru)含適量(liang)培(pei)養(yang)基(ji)的培(pei)養(yang)瓶(ping)中(zhong)(zhong)培(pei)養(yang)過(guo)夜（或將(jiang)細胞(bao)(bao)(bao)懸液加入(ru)(ru)10 cm皿(min)中(zhong)(zhong)，加入(ru)(ru)約8 mL培(pei)養(yang)基(ji)，培(pei)養(yang)過(guo)夜）。第(di)二天換液并(bing)檢(jian)查細胞(bao)(bao)(bao)密度。

2) 細(xi)胞傳代：如果(guo)細(xi)胞密度達 80%-90%，即(ji)可進行傳代培養。

    a、棄去培養上清，用不含鈣、鎂(mei)離子的PBS潤洗(xi)細胞(bao)1-2次。        

    b、加(jia)(jia)(jia)1 mL消化(hua)液(ye)（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培(pei)(pei)養(yang)瓶中，使消化(hua)液(ye)浸潤所有細(xi)(xi)胞，將(jiang)培(pei)(pei)養(yang)瓶置于37℃培(pei)(pei)養(yang)箱中消化(hua)1-2 min（視細(xi)(xi)胞情況(kuang)而定(ding)），然后在(zai)顯微(wei)鏡下觀察(cha)細(xi)(xi)胞消化(hua)情況(kuang)，若細(xi)(xi)胞大部分變(bian)圓并脫落，迅(xun)速拿回操(cao)作臺(tai)，輕敲幾(ji)下培(pei)(pei)養(yang)瓶后加(jia)(jia)(jia)2-3ml培(pei)(pei)養(yang)基終止消化(hua)。輕輕打(da)勻后裝入無菌(jun)離心(xin)(xin)管中，1000 rpm離心(xin)(xin)5 min，棄去(qu)上清液(ye)，補加(jia)(jia)(jia)1-2 mL培(pei)(pei)養(yang)液(ye)后吹勻。        

     c、將細(xi)胞(bao)(bao)(bao)懸(xuan)液(ye)按(an)1:2比例分到新(xin)的含8 mL培(pei)養基的新(xin)皿中或者瓶中，置(zhi)于培(pei)養箱中培(pei)養。 3) 細(xi)胞(bao)(bao)(bao)凍存：待細(xi)胞(bao)(bao)(bao)生長狀態良好(hao)時，可(ke)進行(xing)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)凍存。下面 T25 瓶為例；a、收集細(xi)胞(bao)(bao)(bao)及(ji)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)培(pei)養液(ye)，裝入無菌離(li)心(xin)管中，1000 rpm條(tiao)件下離(li)心(xin)4 min，棄去(qu)上清液(ye)，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行(xing)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)計數。

     b、根據(ju)細(xi)胞(bao)數量(liang)加入(ru)無血(xue)清細(xi)胞(bao)凍存液，使細(xi)胞(bao)密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xi)胞(bao)懸(xuan)液，注(zhu)意凍存管做好標識。將凍存管放入(ru)-80℃冰箱(xiang)，24 h后轉入(ru)液氮灌儲存。記(ji)錄凍存管位置以(yi)便(bian)下次拿取(qu)。  

三、培(pei)養注(zhu)意事項

1. 收到細(xi)胞后(hou)首先(xian)觀察細(xi)胞瓶是(shi)否完好，培養液是(shi)否有漏(lou)液、渾(hun)濁(zhuo)等現象，若(ruo)有上述現象 發生請及時和我們聯(lian)系。

2. 仔(zi)細(xi)(xi)(xi)閱讀細(xi)(xi)(xi)胞(bao)說明書，了解細(xi)(xi)(xi)胞(bao)相關信(xin)息，如細(xi)(xi)(xi)胞(bao)形態、所(suo)用培(pei)養(yang)基、血清比例、所(suo)需(xu) 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)因(yin)子等，確保細(xi)(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)條件一致，若由于培(pei)養(yang)條件不一致而導致細(xi)(xi)(xi)胞(bao)出(chu)現(xian)問題(ti)，責任由 客戶自行(xing)承擔。

3. 用 75%酒精擦拭(shi)細(xi)胞瓶表面，顯微鏡下(xia)觀(guan)察細(xi)胞狀態。因運輸問題，部分細(xi)胞由于溫度(du) 變化及劇烈碰亡破碎(sui)形成碎(sui)片，是(shi)正(zheng)常(chang)現象(xiang)。觀(guan)察好細(xi)胞狀態后(hou)，75%酒精消毒瓶壁將 T25 瓶置于 37℃培養箱(xiang)放(fang)置 2-4h。

4. 貼壁(bi)細(xi)(xi)胞(bao)可以(yi)消化，懸浮細(xi)(xi)胞(bao)直接混勻收(shou)集細(xi)(xi)胞(bao)，900 rpm-1000 rpm 離心 3 min，棄上 清。加(jia) 5 mL PBS 重懸細(xi)(xi)胞(bao)，再 900 rpm-1000 rpm 離心 3 min，用(yong)新鮮的(de)培養(yang)基重懸 細(xi)(xi)胞(bao)，并接種到新的(de)培養(yang)瓶或培養(yang)皿中(zhong)，置于培養(yang)箱中(zhong)進(jin)行培養(yang)。

5. 請客(ke)戶用相同(tong)條件的培(pei)養基用于細胞培(pei)養。

6. 建議客(ke)戶收到細胞(bao)后前(qian) 3 天(tian)各拍幾張細胞(bao)照片，記錄(lu)細胞(bao)狀態(tai)，便于和(he)我司技術部溝通(tong) 交流。由(you)于運輸的(de)原因(yin)，個(ge)別敏感細胞(bao)會(hui)出現不穩定(ding)的(de)情況，請及時和(he)我們(men)聯系(xi)，告知細胞(bao) 的(de)具體情況，以(yi)便我們(men)的(de)技術人員(yuan)跟蹤回訪直至問題解決(jue)。

7. 該細(xi)胞僅供科研使(shi)用。

8. 備注：運(yun)輸用(yong)(yong)的培養(yang)(yang)(yang)基 (灌液培養(yang)(yang)(yang)基) 不(bu)能再用(yong)(yong)來培養(yang)(yang)(yang)細(xi)胞(bao)，請換用(yong)(yong)按(an)照說明(ming)書細(xi)胞(bao)培 養(yang)(yang)(yang)條(tiao)件新(xin)配制的培養(yang)(yang)(yang)基來培養(yang)(yang)(yang)細(xi)胞(bao)。     收到細(xi)胞(bao)后(hou)第一次傳代建議(yi) 1：2 傳代 。

9. 注意：  1:2 傳(chuan)(chuan)代就是 1 個 T25 瓶傳(chuan)(chuan) 2 個 T25 瓶或者 2 個 6cm 皿。不是 1 個 T25 瓶傳(chuan)(chuan) 2 個10cm 皿。

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